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2005

山东临沂西什阜盛能集团奶牛胚胎工程中心科学考察活动安排

时间:2012-03-28来源:youthclub作者:youthclub

一、时间:2005年7月19日——26日  共8天

二、地点:山东临沂西什阜盛能集团奶牛胚胎工程中心

三、活动前的知识准备工作:
  1、7月中旬在中科院动物研究所请指导导师陈大元研究员作“科研实践”指导。
  2、请同学在活动前查阅与科研内容有关资料,充分做好活动前的知识准备工作。

四、科研项目

  动物克隆
   一、克隆动物技术简介
   克隆动物技术是应用现代生物技术“复制”优秀家畜个体,增加良种家畜优秀个体在群体中的比例,从而提高生产效率和经济效益。但是,受胎率低、流产率高、犊牛死亡率高是该技术目前存在的三大难题。这些难题只能意味着应该增加人力、财力、物力的投入,更好地创造和改善科研条件,力争在较短的时间内逐步完善,达到科技开发的预期目标。

   二、技术基础
   由陈大元先生主持的生殖生物学研究室是国家重点实验室。长期以来从事体外授精、显微授精及克隆动物研究。90年代以来,侧重于克隆动物研究。1997年科技部与中国科学院攀登和创新重大项目"克隆大熊猫研究"己获显著进展,三大难题 (胚胎构建、妊娠、产仔)已完成前两项,目前正在着手解决第三个难题。1998年来源于国家自然科学基金委员会的重点项目“家畜体细胞无性繁殖 (克隆牛)研究”下达,在合作单位 (山东省曹县五里墩中大动物胚胎工程中心)配合下,顺利完成,出生克隆牛14头,成活5头,技术指标达到国际先进水平。该成果己经专家鉴定。

  转基因乳腺生物反应器

   一、转基因乳腺生物反应器简介
   二十一世纪是生物高新技术的世纪,转基因动物的研究是当前生物技术研究领域最热门的领域之一。作为转基因动物研究的一个重要方面-乳腺生物反应器更得到了科技界的热情关注。有人把这样的产业称为"基因药物工业"或"分子农场"。动物乳腺生物反应器作为一个为重点开发研究的课题,有着无可比拟的经济价值和应用前景。
   几乎任何有生命的器官或其中一部分都可以经过人为制作而成为生物反应器,如::细菌、酵母、昆虫细胞、植物等等。每一个系统都有其特定的优势和劣势,但是这些系统的产量一般不高,比乳腺生物反应器的产量低得多。
   转基因动物乳腺生物反应器在生产药用蛋白方面还具有另一个优势。它能够生产出具有完全生物活性的药用蛋白,而且产量高,生产成本低,纯化简单。(1)一般高产奶牛每年产奶10吨,而每升乳中获得的药用蛋白为1克,生产I0Kg药用蛋白,也只需要饲养l头转基因牛就行了。(2)生产成本低,一旦建立了转基因动物乳腺生物反应器,只要简单饲养好动物,利用动物乳腺的高表达能力即可源源不断地得到贵重的药用蛋白。(3)药物的分离纯化简单。乳汁内源成分简单,一般纯化工艺就能获得高纯度的产品,且不污染环境。

  二、技术路线:
   (一)基因工程及体细胞转染
    1.白介素因子-2基因的获得:
    从人的血液中分离出淋巴细胞,然后制备总mRNA,转录成cDNA,最后根据已知人白介素因子-2基因的mRNA序列设计PCR引物,扩增出白介素因子-2基因的DNA,并进行序列分析,获得人的白介素因子-2基因。
    2.乳腺蛋白质基因的克隆和改建:
    以奶山羊的β-酪蛋白质基因为制备转基因牛的乳腺生物反应器表达框架。从奶山羊的基因文库中分离出β-酪蛋白质基因,将β-酪蛋白质基因的操纵子和第二外显子的部分序列用为制备转基因牛的乳腺生物反应器的调控区。
    3.基因的连接:
    将调控区与白介素因子-2基因,P(A)和新霉素基因(Neo)连接在一起,构建白介素因子-2基因的转基因牛的乳腺生物反应器的基因载体(如图-1)。


质基因调控区
备注:1,外显子I;2,外显子Ⅱ; Ⅲ-2,白介素因子-2基因;终止信号;Neo,筛选基因。

    4.成体细胞的培养和基因转化:
    从高产奶牛的耳尖处取一小块组织,用胰酶消化。然后在含10%FCS的DMEM培养基中培养10-12天,用Fugene6(Roche),按公司的操作方法将白介素因子-2基因载体转化耳尖成纤维细胞,用每毫升600微克的G418进行筛选培养。在15-20天的筛选后,阳性细胞株,一部分细胞冷冻保存,然后用于动物克隆。另一小部分用于制备DNA,PCR分析细胞株的白介素因子-2基因的整合。
   (二)转基因胚胎的重构 (核移植)把转基因阳性表达细胞移植到去核卵的卵周隙中,经电融合,构成重构卵,培育成重构胚,移入受体牛子宫中,产出克隆牛犊。
   (三)牛乳中Ⅲ-2的纯化及表达量检测
    1.采用的白介素-2抗体,过柱纯化等方法
    2.用乳胶电泳等方法确定表过量

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